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自噬的過(guò)程——從一張圖片開(kāi)始:
步驟1:細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后,在胞漿的某處形成一個(gè)小的類似“脂質(zhì)體”樣的膜結(jié)構(gòu),然后不斷擴(kuò)張,但它并不呈球形,而是扁平的,就像一個(gè)由2層脂雙層組成的碗,可在電鏡下觀察到,被稱為Phagophore,是自噬發(fā)生的鐵證之一。
步驟2:Phagophore不斷延伸,將胞漿中的任何成分,包括細(xì)胞器,全部攬入“碗”中,然后“收口”,成為密閉的球狀的autophagosome,我把它翻譯為“自噬體”。電鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的鐵證之二。有2個(gè)特征:一是雙層膜,二是內(nèi)含胞漿成分,如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等。
步驟3:自噬體形成后,可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合(加了個(gè)“可”字,意思是這種情況不是必然要發(fā)生的)。
步驟4:自噬體與溶酶體融合形成autolysosome,期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解,2者的內(nèi)容物合為一體,自噬體中的“貨物”也被降解,產(chǎn)物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞漿中,供細(xì)胞重新利用,而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞漿中。
透射電鏡下自噬的照片:
自噬的特性:
(1)自噬是細(xì)胞消化掉自身的一部分,即self-eating,初一看似乎對(duì)細(xì)胞不利。事實(shí)上,細(xì)胞正常情況下很少發(fā)生自噬,除非有誘發(fā)因素的存在。這些誘發(fā)因素很多,也是研究的熱門。既有來(lái)自于細(xì)胞外的(如外界中的營(yíng)養(yǎng)成分、缺血缺氧、生長(zhǎng)因子的濃度等),也有細(xì)胞內(nèi)的(代謝壓力、衰老或破損的細(xì)胞器、折疊錯(cuò)誤或聚集的蛋白質(zhì)等)。由于這些因素的經(jīng)常性存在,因此,細(xì)胞保持了一種很低的、基礎(chǔ)的自噬活性以維持自穩(wěn)。
(2)自噬過(guò)程很快,被誘導(dǎo)后8min即可觀察到自噬體(autophagosome)形成,2h后自噬溶酶體(autolysosome)基本降解消失。這有利于細(xì)胞快速適應(yīng)惡劣環(huán)境。
(3)自噬的可誘導(dǎo)特性:表現(xiàn)在2個(gè)方面,*是自噬相關(guān)蛋白的快速合成,這是準(zhǔn)備階段。第二是自噬體的快速大量形成,這是執(zhí)行階段。
(4)批量降解:這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區(qū)別
(5)“捕獲”胞漿成分的非特異性:由于自噬的速度要快、量要大,因此特異性不是首先考慮的,這與自噬的應(yīng)急特性是相適應(yīng)的。
(6)自噬的保守性:由于自噬有利于細(xì)胞的存活,因此無(wú)論是物種間、還是各細(xì)胞類型之間(包括腫瘤細(xì)胞),自噬都普遍被保留下來(lái)(誰(shuí)不喜歡留一手呢?)。
自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene, ATG):在自噬過(guò)程中到底有哪些蛋白的參與,即自噬相關(guān)蛋白的鑒定是目前自噬研究主要的任務(wù)。由于自噬研究的歷史關(guān)系,很多基因在酵母和哺乳動(dòng)物中有不同的命名。
自噬過(guò)程的調(diào)控:
從上面總結(jié)的自噬特點(diǎn)中可以看出,自噬這一過(guò)程一旦啟動(dòng),必須在度過(guò)危機(jī)后適時(shí)停止,否則,其非特異性捕獲胞漿成分的特性將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷。這也提醒我們?cè)谘芯孔允蓵r(shí)一定要?jiǎng)討B(tài)觀察,任何橫斷面的研究結(jié)果都不足以評(píng)價(jià)自噬的活性。
目前,已經(jīng)報(bào)告了很多因素能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬,如饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏、微生物感染、細(xì)胞器損傷、蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等等,這么多刺激信號(hào)如何傳遞的、哪些自噬蛋白接受信號(hào)、又有哪些自噬蛋白去執(zhí)行等很多問(wèn)題都還在等待進(jìn)一步解答中。
關(guān)于傳遞自噬信號(hào)的通路目前比較肯定的有:
抑制類
(1)Class I PI3K pathway (PI——phosphatidylinositol,磷脂酰肌醇)與IRS (Insulin receptor substrate) 結(jié)合,接受胰島素受體傳來(lái)的信號(hào)(血糖水平高抑制自噬)。
(2)mTOR在人類中的同源基因是FRAP1(FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1),是一個(gè)絲/蘇氨酸蛋白激酶。能接受多種上游信號(hào),如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK,能感受營(yíng)養(yǎng)和能量的變化。
激活類
(1)Class III PI3K
結(jié)構(gòu)上類似于Class I PI3K,但作用相反。
接受上述信號(hào)的自噬蛋白:
目前都把焦點(diǎn)集中在beclin 1(酵母同源物為atg6),能與多種蛋白結(jié)合,如Vps34(Class III PI3K的催化亞單位),mTOR,BCL-2和BCLXL蛋白等,需注意的是,beclin-1是一個(gè)多功能蛋白,除了接受自噬信號(hào),它還可以接受很多其它的信號(hào)對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié),越來(lái)越多的證據(jù)表明,beclin-1可能是自噬的“守門人”。
自噬體的發(fā)生:
目前認(rèn)為,自噬體的膜不是直接來(lái)源于高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng),而是在胞漿中重新生成的,但具體的機(jī)制尚不清楚。當(dāng)beclin-1被活化后,胞漿中先形成很多個(gè)membrane source(自噬體膜發(fā)生中心),在它們不斷擴(kuò)展的過(guò)程中(phagophore到autolysosome),VMP1蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體轉(zhuǎn)位到自噬體膜上(VMP1又叫TMEM49,已知*與自噬有關(guān)的跨膜蛋白),同時(shí),MAP1-LC3由胞漿型(即LC3-I)轉(zhuǎn)位到自噬體膜(即LC3-II),LC3這一轉(zhuǎn)變過(guò)程可被Western Blot和熒光顯微鏡檢測(cè)到,現(xiàn)已成為監(jiān)測(cè)自噬體形成的推薦方法。
自噬與細(xì)胞死亡的關(guān)系:
有必要說(shuō)明一下的是,細(xì)胞死亡是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,為了研究方便,需進(jìn)行分類,但我們思考時(shí)不要局限于這些人為的分類,而應(yīng)注重于現(xiàn)象本身來(lái)研究其背后的機(jī)制。
一直以來(lái)人們從不同角度、用不同方法來(lái)觀察細(xì)胞的死亡,并把細(xì)胞的死亡方式分為2類:壞死和凋亡,因?yàn)閮烧哂兄黠@的區(qū)別,其中zui主要的區(qū)別之一就是細(xì)胞膜的通透性——壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜喪失了完整性,內(nèi)容物被釋放出來(lái),染料可自由進(jìn)入細(xì)胞,而凋亡細(xì)胞保持完整,無(wú)內(nèi)容物釋放,染料也被排斥。很多實(shí)驗(yàn)亦根據(jù)這一原理來(lái)設(shè)計(jì)以區(qū)分壞死和凋亡,這將在后面一一介紹,如同剛剛說(shuō)明的那樣,這些實(shí)驗(yàn)只能說(shuō)明細(xì)胞膜的通透性(必要條件,不是充分必要條件),而不能用來(lái)證實(shí)壞死細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。
一般認(rèn)為壞死是被動(dòng)的,不可控的,而凋亡是主動(dòng)的,可控的。為了強(qiáng)調(diào)這一點(diǎn),凋亡被定義為程序性細(xì)胞死亡(program cell death,PCD)。但無(wú)論是壞死還是凋亡,都是一個(gè)過(guò)程,是需要時(shí)間的(尤其是凋亡,從啟動(dòng)到完成,細(xì)胞要執(zhí)行很多反應(yīng)),而且細(xì)胞死亡后都有“尸體”。
在研究自噬與凋亡的關(guān)系時(shí),人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡前胞漿中存在大量的自噬體或自噬溶酶體,但這樣的細(xì)胞缺乏凋亡的典型特點(diǎn),如核固縮(pyknosis), 核破裂(karyorhexis)、細(xì)胞皺縮(shrinkage)、沒(méi)有凋亡小體的形成等,被稱為自噬樣細(xì)胞死亡(autophagic cell death,ACD),它是一種新的細(xì)胞程序性死亡,為了與凋亡區(qū)別,被命名為Type II cell death,相應(yīng)的,凋亡為Type I cell death,壞死為Type III cell death。
盡管這樣,但對(duì)于自噬是否是細(xì)胞死亡的直接原因目前還存在很大的爭(zhēng)議。到底是Cell death by autophagy(自噬引起死亡)還是Cell death with autophagy(死亡時(shí)有自噬發(fā)生,但不是直接原因)?對(duì)此,自噬研究領(lǐng)域“大牛”級(jí)專家Levine Beth在一篇nature的Review中表達(dá)了自己的觀點(diǎn)。由于在形態(tài)學(xué)上2者無(wú)明顯區(qū)別,但通過(guò)阻斷自噬,觀察細(xì)胞的結(jié)局可區(qū)分開(kāi)來(lái):Cell death by autophagy細(xì)胞存活,而Cell death with autophagy細(xì)胞死亡。
自噬與腫瘤的關(guān)系:
與凋亡(在腫瘤細(xì)胞中一般都存在缺限)不同,自噬是被優(yōu)先保留的。無(wú)論是腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞,保持一種基礎(chǔ)、低水平的自噬活性是至關(guān)重要的。因?yàn)榧?xì)胞中隨時(shí)產(chǎn)生的“垃圾”(破損或衰老的細(xì)胞器、長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)、錯(cuò)誤合成或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)等等)都需要及時(shí)清除,而這主要靠自噬來(lái)完成,因此,自噬具有維持細(xì)胞自穩(wěn)的功能;如果將自噬相關(guān)基因突變失活,如神經(jīng)元會(huì)發(fā)生大量聚集蛋白,并出現(xiàn)神經(jīng)元退化。同時(shí),自噬的產(chǎn)物,如氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)又可為細(xì)胞提供一定的能量和合成底物,可以說(shuō),自噬就是一個(gè)“備用倉(cāng)庫(kù)”。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上*口奶之前就會(huì)餓死。更重要的是,自噬活性可在代謝應(yīng)激(饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏、射線、化療等)時(shí)大大增強(qiáng),表現(xiàn)為胞漿中迅速涌現(xiàn)大量自噬體,這一現(xiàn)象被稱為“自噬潮”(autophagic flux),廣泛用于自噬形成的監(jiān)測(cè)。自噬潮為細(xì)胞度過(guò)危機(jī)提供了緊急的營(yíng)養(yǎng)和能量支持,有利于細(xì)胞的存活。
鑒于自噬的上述作用,自噬可為腫瘤細(xì)胞帶來(lái)幾大好處:
(1)腫瘤細(xì)胞本身就具有高代謝的特點(diǎn),對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量的需求比正常細(xì)胞更高,但腫瘤微環(huán)境往往不能如意,如腫瘤發(fā)生初始期到血管發(fā)生之前、腫瘤長(zhǎng)大發(fā)生血管崩塌時(shí)、腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶游走時(shí)等都會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不足或供應(yīng)中斷,而此時(shí)提高自噬活性可以有助于度過(guò)這一危機(jī)。
(2)當(dāng)化療、放療后,腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的破損細(xì)胞器、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分,而此時(shí)提高自噬活性可及時(shí)清除這些有害物質(zhì),并提供應(yīng)急的底物和能量為修復(fù)受損DNA贏得時(shí)間和條件。
由于自噬減少了腫瘤細(xì)胞在代謝應(yīng)激時(shí)發(fā)生壞死的機(jī)會(huì),而對(duì)于腫瘤細(xì)胞群體而言,需要一部分細(xì)胞發(fā)生壞死,以引發(fā)適度的炎癥(有利于血管的長(zhǎng)入、吸引免疫細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子等)。研究發(fā)現(xiàn),很多類型的腫瘤在代謝應(yīng)激時(shí)會(huì)“組成性”活化PI3K信號(hào)以抑制自噬(由于凋亡通路已受阻,抑制自噬會(huì)促進(jìn)壞死),但具體機(jī)制尚不清楚。
自噬的研究方法:
正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低,不適于觀察,因此,必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié),經(jīng)報(bào)道的工具藥有:
(一)自噬誘導(dǎo)劑
1. Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
2. Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化鋰):IMPase 抑制劑(即Inositol monophosphatase,肌醇單磷酸酶)
3. Earle's平衡鹽溶液:制造饑餓
4. N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制劑
5. Rapamycin:mTOR抑制劑
6. Xestospongin B/C:IP3R阻滯劑
(二)自噬抑制劑
1. 3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制劑
2. Bafilomycin A1:質(zhì)子泵抑制劑
3. Hydroxychloroquine(羥氯喹):Lysosomal lumen alkalizer(溶酶體腔堿化劑)
除了選用上述工具藥外,一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù):包括反義RNA干擾技術(shù)(Knockdown)、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/span>