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實驗室新手指南之細胞培養(yǎng)
  • 發(fā)布日期:2017-12-22      瀏覽次數:1654
    •  細胞原代培養(yǎng)

      • 胰酶消化法
      1. 1、器材:將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死,置 75%酒精泡 2—3 秒鐘(時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠帶入超凈臺內(或將新生小鼠在超凈臺內)解剖取肝臟,置平皿中。
      2. 2、用 Hank’s 液洗滌三次,并剔除脂肪,結締組織,血液等雜物。
      3. 3、用手術剪將肝臟剪成小塊(1mm2),再用 Hank’s 液洗三次,轉移至小青霉素瓶中。
      4. 4、視組織塊量加入 5—6 倍的 0.25%胰酶液,37℃中消化 20—40 分鐘,每隔 5 分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細胞分離。
      5. 5、加入 3—5ml 培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。
      6. 6、靜置 5—10 分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。
      7. 7、1000rpm,離心 10 分鐘,棄上清液。
      8. 8、加入 Hank’s 液 5ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
      9. 9、加入培養(yǎng)液 l—2 ml(視細胞量),血球計數板計數。
      10. 10、將細胞調整到 5×105/ml 左右,轉移至 25ml 細胞培養(yǎng)瓶中,37℃下培養(yǎng)。

      上述消化分離的方法是zui基本的方法,在該方法的基礎上,可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同,所采用的消化酶也不相同(如膠原酶,透明質酶等)。

      • 組織塊直接培養(yǎng)法

      自上方法第 3 步后,將組織塊轉移到培養(yǎng)瓶,貼附與瓶底面。翻轉瓶底朝上,將培養(yǎng)液加至瓶中,培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入 37℃ 靜置 3—5 小時,輕輕翻轉培養(yǎng)瓶,使組織浸入培養(yǎng)液中(勿使組織漂起),37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

      • 貼壁細胞傳代方法
      1. 1、吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。
      2. 2、加入1-2 mL 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準)靜置 2-10min(顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測) 。
      3. 3、吸去胰蛋白酶液,加入培養(yǎng)液。
      4. 4、吸取瓶內培養(yǎng)液,反復吹打瓶壁細胞,形成細胞懸液。
      5. 5、吸取細胞懸液,接種于新的培養(yǎng)瓶內。
      6. 6、加適量新鮮培養(yǎng)液于新培養(yǎng)瓶內。
      7. 7、將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
    魏經理
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